Question

【題目】某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光,這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5'末端,獲得了L1-GFP融合基因(簡稱甲),并將其插入質(zhì)粒P0。構(gòu)建了真核表達載體P1,其部分結(jié)構(gòu)和酶切點的示意圖如下,圖中E1~E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同。

回答下列問題:

(1)據(jù)圖推斷,該團隊在將甲插入質(zhì)粒P0時,使用了兩種限制酶,這兩種酶是__________。圖中的啟動子可作為_______________的結(jié)合位點，催動轉(zhuǎn)錄的進行。

(2)將P1轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的牛皮膚細胞后,若在該細胞中觀察到了_________,則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成表達�；�因工程的核心步驟是______________________。

(3)通過___________的方法將目的基因?qū)�入牛�?/span>________中，再經(jīng)過早期胚胎培養(yǎng)，胚胎移植等過程，獲得含有甲的轉(zhuǎn)基因牛。

(4)為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中,某同學(xué)用PCR方法進行鑒定。在鑒定時應(yīng)分別以該牛不同組織細胞中的______________ (填"mRNA""總RNA"或"核DNA")作為PCR模板。

Answer 1

【答案】E1和E4 RNA聚合酶 綠色的熒光 基因表達載體的構(gòu)建 顯微注射 受精卵 核DNA

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

(1) 使用E1、E4這兩種酶進行酶切可以保證目的基因甲的完整性， 圖中的啟動子可作為RNA聚合酶的結(jié)合位點，催化轉(zhuǎn)錄的進行。

(2) 在該細胞中觀察到了綠色的熒光，說明基因已表達，即L1基因在牛的皮膚細胞中完成了轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。基因工程的核心步驟是基因表達載體的構(gòu)建。

(3)通過顯微注射的方法將目的基因?qū)�入牛的受精卵中，再進行體外培養(yǎng)、胚胎移植等相關(guān)操作獲得轉(zhuǎn)基因牛。

(4) 為檢測L1-GFP融合基因是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學(xué)用PCR方法進行鑒定。PCR技術(shù)是體外DNA復(fù)制技術(shù)，故在鑒定時應(yīng)分別以該牛不同組織細胞中的核DNA作為PCR模板 。